本文于年6月份发表在《Cell》，通讯作者是来自美国密歇根大学的NobuhikoKamada教授，研究了口腔炎症，例如牙周炎，通过向肠道供应致病性病原菌和致病性T细胞，加剧了肠道炎症。
背景
最近的越来越多的证据表明，在胃肠道疾病如炎症性肠病（IBD）以及结直肠癌的发病机制中，可能存在“口肠轴”。比如这篇文献通过细菌16SrRNA基因测序分析了35例IBD患者唾液微生物群的组成，表明IBD患者唾液菌群中拟杆菌门菌群明显增加，变形菌门菌群同时减少。唾液菌群的生态失调与IBD患者的炎症反应有关，提示它可能与肠道菌群的生态失调有关。
口腔是IBD肠外表现的常见部位，尤其是克罗恩病（CD）。与非IBD对照组相比，CD患者的牙周炎患病率显着增加。这些观察结果表明发生在口腔和肠粘膜上的炎症过程可能以某种方式联系在一起。但是，牙周炎症影响胃肠道疾病的程度尚待充分阐明。
IBD患者的粘膜组织中富含典型的驻留口腔细菌，例如Fusobacteriaceae，Pasteurellaceae和Veillonellaceae。
除了积聚病菌外，细菌反应性CD4+T细胞在IBD患者的肠粘膜中蓄积，并被认为在疾病发病机理中起着核心作用。然而，这些细菌反应性病原性T细胞产生的机制仍然是未知的。
据报道，在口腔引流淋巴结中发现的免疫细胞可以迁移到其他淋巴器官，包括肠道。因此，口腔炎症可能引起口腔病原反应性T细胞的出现。然后，致病性T细胞从口腔粘膜迁移到肠道，在那里它们被肠道细菌激活并引起肠道炎症。
摘要
口腔感染导致口腔外疾病发病的确切机制尚不清楚。在这里，我们报道牙周炎症会在体内加剧肠道炎症。牙周炎导致口腔内病原菌的增殖，包括克雷伯菌和肠杆菌种。口腔内积累的病原菌被摄入，并转移至肠道，在那里它们激活结肠单核吞噬细胞中的炎症小体，从而引发炎症。同时，牙周炎导致在口腔中产生口腔病原体反应性Th17细胞。口腔病原体反应性Th17细胞迁移至发炎的肠道。当进入肠道时，口腔起源的Th17细胞可被易位的口腔致病菌激活并引起结肠炎的发展，但不会被肠道内的微生物激活。因此，口腔炎症，例如牙周炎，通过向肠道供应致病性病原菌和致病性T细胞，加剧了肠道炎症。
结果
图一：诱导牙周炎模型
为了研究口腔炎症对胃肠道疾病的影响，我们采用了结扎诱导的牙周炎模型。结扎后14天，大量牙槽骨丢失。结扎后3天和7天会导致血清淀粉样蛋白A（SAA）短暂升高，这是炎症的一种非特异性标志物，但全身炎症在第14天就消失了。没有观察到细菌向外周血的移位。相反，由结扎引起的口腔生态失调仍持续存在。
图二：牙周炎加重肠道炎症
结扎后第14天，用右旋糖酐硫酸钠（DSS）处理小鼠以诱发实验性结肠炎。与对照组相比，结扎后给予DSS组的小鼠体重显着减轻并且疾病活动指数（DAI）值更高。同样，与对照组相比，结扎-DSS组的小鼠结肠黏膜炎症程度更高。为了进一步表征结扎DSS小鼠中的免疫应答，我们对小鼠结肠固有层的免疫细胞进行了质谱流式分析。我们根据表面标记物表达谱对免疫亚群进行了聚类，发现DSS处理可显着增加髓系和淋巴细胞浸润，如图所示。有趣的是，仅结扎治疗也可以增强免疫细胞（包括Th17亚群，B细胞和γδT细胞）渗透到肠道固有层中。值得注意的是，我们在接受结扎和DSS治疗的组中观察到了对静止和激活的Th17亚型（分别为12和14位）增殖的明显累加效应。
图三：结扎诱导的牙周炎加剧了肠道炎症，并积累了Th17和Th1细胞
为了定量验证Th17细胞数量的增加，接下来进行了常规的流式分析。与质谱流式结果一致，结扎-DSS组的CD3+CD4+T细胞与对照组相比显着增加。进一步表征表明，与单独的DSS相比，结扎DSS的小鼠中RORγt+T-bet+/-Th17细胞和RORγt-T-bet+Th1细胞显着富集，而Foxp3+调节性T细胞（Tregs）的丰度没有变化。并且，从结扎-DSS小鼠中分离出的结肠CD3+CD4+T细胞产生的白介素17A（IL-17A）和干扰素γ（IFN-γ）明显高于仅从DSS或非DSS对照小鼠分离出的结肠细胞。这些结果表明，结扎诱导的牙周炎加剧了肠道炎症，并积累了Th17和Th1细胞。
图四：牙周炎导致口腔生态失调
接下来，我们分析了结扎-DSS小鼠的口腔和肠道微生物组。如先前报道，牙周炎导致口腔生态失调。在牙周炎期间，肠杆菌科尤其占优势。
图五：牙周炎导致肠杆菌科细菌在口腔和肠道中均积累
为了鉴定牙周炎存在时口腔和肠粘膜中常见的细菌类群，进行了LEfSe分析。有趣的是，与没有结扎的DSS处理的小鼠相比，经结扎的DSS处理的小鼠的肠道中也富集了肠杆菌科细菌（OTU），该肠杆菌科也是牙周炎期间口腔中最丰富的细菌类群。我们进一步鉴定了通常在口腔和肠粘膜上定殖的肠杆菌科菌种。我们发现克雷伯菌属和肠杆菌属，是发炎口腔中最主要的物种。在有结扎的小鼠中，这些细菌物种的肠道定殖增加了。这些发现表明，病原体在口腔中大量繁殖，导致肠道内相同细菌种类的积累。而单独的结扎并不会导致这些细菌的肠道定植增加。该结果表明，健康的肠道菌群可防止因摄入口腔病原菌而引起异位肠道定植。肠道炎症可能会破坏肠道菌群介导的定植抗性，从而使口腔病原菌能够定居于肠道。
图六：口腔病原菌可以在肠道中引起致病反应
为了验证口腔病原菌是否可以在肠道中引起致病反应，从健康（健康口腔微生物群[HOM]）或牙周炎小鼠（结扎相关口腔微生物群[LOM]）中分离出口腔微生物群，将其移植到无菌（GF）Il10-/-小鼠中。在实验过程中，与定殖HOM的Il10-/-小鼠相比，定殖LOM的Il10-/-小鼠表现出体重增加减缓和粪便脂钙蛋白-2（Lcn2）水平升高。同样，与HOM组相比，LOM组的结肠炎症明显加重。
图七：口腔肠杆菌科细菌的定植导致遗传易感宿主发生结肠炎
接下来，为了确定引起结肠炎的口腔病原体菌株，我们生成了由分别代表HOM和LOM的细菌菌株组成的合成微生物群落。在HOM菌群中，分离了几种属于最丰富属的菌株，即链球菌和葡萄球菌（例如唾液链球菌，链球菌sp.JS71和xylosus葡萄球菌），然后进行混合以合成合成HOM（sHOM）。为了制作合成LOM（sLOM），需要分离几种在LOM菌群中最普遍的肠杆菌科菌株（例如，产气克雷伯菌，肺炎克雷伯菌，水痘克雷伯菌，阴沟肠杆菌和E.hormaechei），混合。将这些合成菌群定殖在GFII10-/-小鼠。在GFII10-/-小鼠中，sHOM和sLOM均等地定殖。观察到，与sHOM定殖的II10-/-小鼠相比，sLOM定殖的II10-/-小鼠观察到粪便Lcn2水平升高和病理加剧。同样，与SHOM定殖II10-/-小鼠相比，在sLOM定殖后，Th17和Th1细胞的积累增加。这些结果表明，口腔肠杆菌科细菌的异位定植可在遗传易感宿主中引发结肠炎。
图八：口腔病原体通过肠道单核吞噬细胞激活炎性小体介导的IL-1β分泌而诱发结肠炎。
与这些观察结果一致，与GF对照或HOM定植的组相比，LOM定植的IL10-/-小鼠显示出更突出的与炎性体相关的分子标记（例如，IL-1β）。为了鉴定IL-1β的细胞来源，我们接下来在sHOM或sLOM定殖的II10-/-小鼠的结肠固有层（LP）细胞中探索了产生IL-1β的细胞。如图4B和4C所示，与sHOM定殖的或对照GFIL10-/-小鼠相比，在sLOM定殖的IL10-/-小鼠中IL-1β产生细胞显着增加。大多数产生IL-1β的细胞被鉴定为炎性巨噬细胞（Ly6ClowMHC-IIhighCD64high）。
接下来，确定了由口腔病原菌经肠道定植诱导的IL-1β参与结肠炎的发病的程度。为此，我们在sHOM和sLOM定殖的限菌小鼠中使用了DSS诱导的结肠炎模型，并通过施用IL-1受体拮抗剂Anakinra来抑制IL-1β信号传导。类似于IL10-/-小鼠，当施用DSS时，sLOM定殖的小鼠发展为更为严重的结肠炎。Anakinra处理可明显减轻sLOM定殖小鼠的结肠炎，表明IL-1β在口腔病原体驱动的肠道疾病中的关键作用。接下来，验证了每种口腔致病菌株诱导巨噬细胞诱导IL-1β分泌的能力。与从HOM分离的那些不同，从LOM分离的口腔病原体在骨髓源性巨噬细胞（BMDM）和结肠固有层细胞中诱导IL-1β的大量产生。而从肠中分离出的肠杆菌科（大肠杆菌菌株SK和SK）或其他革兰氏阴性菌株（拟杆菌杆菌，统一芽孢杆菌和B寻常性（Vulgatus）都不能诱导IL-1β分泌。一致地，这些源自肠的大肠杆菌和拟杆菌属菌株的定殖未导致在GFIL10-/-小鼠中结肠炎的发展。因此，IL-1β诱导能力可能是口腔致病菌的标志。
尽管我们表明口腔致病菌在肠道内定殖可以引起结肠炎的发展，但仍有可能仅在缺乏具有免疫调节功能的共生微生物的情况下发生。为了确定在存在竞争性微生物的情况下通过口腔病原体进行肠道定殖是否足以加剧肠道炎症，我们在DSS模型中，用LOM中最丰富的细菌-产气克雷伯菌菌株SK移植给了SPF小鼠。诱发的结肠炎模型。与限菌小鼠实验一致，通过肠道定殖产气克雷伯菌会恶化DSS诱导的SPF小鼠的结肠炎。Anakinra处理能够扭转产气克雷伯菌定植引起的肠道炎症。这些结果意味着通过口腔病原菌，如产气克雷伯菌的异位肠道定殖，足以加剧由激活的IL-1信号传导的结肠炎。
接下来，我们确定了哪些炎性小体蛋白与口腔病原菌诱导的IL-1β有关。当缺失NLRP3，PYCARD，CASP1，和Casp11时，由产气克雷伯菌刺激的骨髓来源巨噬细胞分泌的IL-1β减少或缺失。鉴于caspase11作用在NLRP3炎性体的上游，这一结果表明，口腔病原体产气克雷伯菌可能通过caspase-11介导的非经典炎性小体激活，诱导IL-1β产生。Aim2炎性小体似乎也有部分参与。与这些体外观察结果一致，产气克雷伯菌定植没有在缺乏NLRP3，PYCARD，CASP1，或Casp11的小鼠中加剧结肠炎。总之，口腔病原菌，如产气克雷伯菌，在肠道定殖，通过在巨噬细胞炎性小体介导的IL-1信号传导的激活增强肠道炎症。
图九：牙周炎期间在口腔中出现口腔病原反应性T细胞
除了将口腔病原体递送到肠道外，牙周炎还可以通过免疫的方式影响结肠炎的严重程度。之前已经发现，与仅患有DSS结肠炎的小鼠相比，结扎-DSS小鼠的结肠黏膜中Th17和Th1细胞大量积聚。因为急性结肠炎模型可能缺乏足够的时间来发展出肠道中的记忆T细胞反应，所以我们假设这些T细胞是先出现在口腔粘膜中并迁移到肠道。为了验证这个假设，我们首先表征了口腔中牙周炎引起的免疫反应。我们发现CD3+CD4+CD44highCD62L?效应记忆T（TEM）细胞积聚在颈淋巴结（cLNs）中。这些TEM细胞表达RORγt+并产生大量IL-17A，同时产生有限量的IFN-γ和IL-10，表明与牙周疾病有关的口腔TEM细胞表现出Th17表型。为了确定口腔TEM细胞的抗原特异性，用口腔细菌抗原激活的树突细胞（DC）刺激cLNCD4+T细胞。如图所示，从对照小鼠分离的cLNCD4+T细胞不能识别口腔共生抗原，而从结扎小鼠分离的cLNCD4+T细胞对口腔共生抗原有反应。从结扎小鼠中分离出的cLNCD4+T细胞对从结扎小鼠中分离出的口腔细菌抗原的反应比从健康小鼠中分离出的更为强烈。
为了鉴定激活口腔Th17TEM细胞的特定细菌，我们使用了通常分别与健康的口腔黏膜，牙周炎期间的口腔黏膜和肠道黏膜相关的不同的单一细菌菌株。口腔TEM细胞对积聚在发炎的口腔粘膜中的克雷伯菌/肠杆菌spp有反应。相反，在健康的口腔中通常发现的口腔细菌，和从肠粘膜分离的细菌均不能激活口腔TEM细胞。这些结果表明，牙周炎诱导口腔病原体特异性Th17TEM细胞的产生。值得注意的是，在IL-1R-/-小鼠中，牙周炎期间口腔病原体特异性Th17TEM细胞的生成明显减弱，但没有消除。因此，口腔病原体诱导的IL-1β信号传导可能至少部分参与Th17细胞的产生。
因此，如前所述，由牙周炎引起的口腔病原体特异性Th17TEM细胞可能会迁移到肠道。为了评估肠道中口腔Th17TEM细胞的致病能力，将cLN衍生的TEM细胞移植到无菌Rag1-/-小鼠。先将sLOM或sHOM移植到GFRag1-/-小鼠14天。此时两组小鼠未观察到明显的炎症反应（粪便Lcn2）。重建14天后，分别分离没结扎或结扎了的小鼠的cLN的口腔TEM细胞，移植给Rag1-/-小鼠。口腔TEM细胞的过继转移只在sLOM定殖的Rag1-/-小鼠中引起结肠炎的发展。
流式分析了两组小鼠结肠中的免疫细胞，发现口腔TEM细胞不能在sHOM定殖的小鼠的结肠黏膜中扩增，却可以在sLOM定殖小鼠中增殖，这表明口腔TEM细胞的抗原特异性增殖可能是诱导结肠炎所需的。尽管口腔病原体反应性TEM细胞在口腔中出现时表现出Th17表型并在迁移后在肠道中增殖，但仍不清楚Th17表型是否在转移到肠道后对诱导炎症至关重要。
因此，使用IL-17A-EGFP报告小鼠，在结扎诱导牙周炎第14天时，从cLNs分选出产生IL-17A的TEM细胞（EGFP+细胞）和不产生IL-17A的TEM细胞（EGFP-）。然后将分选出的IL-17A-EGFP+和IL-17A-EGFP–口腔TEM细胞转移到定殖了口腔病原菌的Rag1-/-受体小鼠。正如预期的那样，移植IL-17A-EGFP+的而不是IL-17A-EGFP-口腔TEM细胞可引发结肠炎的发展。这些结果表明，当口腔病原体反应性Th17TEM细胞能够迁移到肠道时，它们可能促进或加剧了肠道炎症。
图十：经口刺激的T细胞转移到肠粘膜
为了确定在免疫力正常的动物中牙周炎发生后口腔T细胞向肠道的迁移，我们使用了Kaede转基因小鼠。Kaede小鼠中的所有细胞类型均表达可光转换的Kaede-Green荧光蛋白。当此蛋白质暴露于紫光下时，该蛋白质的颜色从Kaede-Green变为Kaede-Red。通过分析目的器官中Kaede-Red荧光蛋白的表达，该工具可用于跟踪体内的细胞运动。我们首先检查了稳态条件下T细胞从cLNs到肠道的迁移。将Kaede转基因（Tg）小鼠的cLN暴露在紫光下。然后分析了cLN，肠系膜淋巴结（mLNs）和结肠LP（cLP）中的Kaede-Red+CD3+CD4+T细胞。通过短期暴露于紫光，cLN中40％以上的T细胞得以转化。然后Kaede-Red+细胞从cLNs易位，并在7天之内被传入的Kaede-Green+细胞替代（稳态白细胞循环）。在第7天在mLNs中检测到Kaede-Red+细胞，而在光转化（1.5h）之后，这些细胞均不存在，提示cLN中的T细胞可以在生理条件下迁移到肠道。与mLNs相反，在cLP中未检测到Kaede-Red+CD4+T细胞。接下来，我们评估了肠道炎症对将口腔T细胞归巢至肠道的影响。将KaedeTg小鼠进行口腔结扎，并在14天后用紫光照射cLN，然后在1天后进行DSS处理。结扎和DSS结肠炎都不会单独导致口腔T细胞向cLP迁移。相比之下，在经DSS处理的口腔结扎小鼠的cLP中，发现Kaede-Red+CD4+T细胞数量增加。结肠粘膜中的Kaede-Red+CD4+T细胞主要表现出Th17（RORγt+和RORγt+T-bet+）表型和有限数量的Foxp3+细胞。因此，经口刺激的T细胞能够迁移到肠粘膜。
图十一：经口刺激的T细胞在肠道中有致结肠炎能力
为了验证肠道中Kaede-Red+CD3+CD4+T细胞的致结肠炎能力，我们纯化了从结扎-DSS小鼠的cLP分离的Kaede-Red+CD3+CD4+T细胞，然后将这些细胞移植到SPFRag1-/-小鼠。从DSS处理的小鼠的cLP中分离出的纯化的Kaede-Green+CD3+CD4+T细胞用作对照。与我们的预期相反，Kaede-Red+CD3+CD4+T细胞的移植没有引起SPFRag1-/-小鼠结肠炎的发展，因为在8周的时间内粪便Lcn2水平没有升高。我们推论该表型是由于肠内微生物无法激活转移的口腔病原反应性T细胞而引起的。换句话说，激活肠道中的口腔细菌反应性T细胞需要扩增肠道中的口腔病原体。接下来通过用口腔致病性产气克雷伯菌定殖小鼠来模拟这一假说，模仿肠道中大量的口腔致病性细菌。根据计算，一般人每天会吞咽1.5×10^12口腔细菌（1.5×10^12/天/70公斤0.53×10^9/管/25-g小鼠），每周给小鼠接种1×10^9产气克雷伯菌3次，共4周。在假对照Rag1?/?小鼠或用Kaede-Green+CD3+CD4+T细胞重组的Rag1?/?小鼠中，产气克雷伯菌定殖肠道不会引发肠道炎症(粪便Lcn2测定)。而产气克雷伯菌灌胃导致用Kaede-Red+CD3+CD4+T细胞重组的Rag1?/?小鼠出现严重结肠炎。
值得注意的是，通过使用IL-1R拮抗剂anakinra处理，转移了Kaede-Red+CD3+CD4+T细胞的小鼠的肠道病理显着减弱。这伴随着结肠中CD4+T细胞以及RORγt+和RORγt+T-bet+Th17细胞总数的减少。与该结果一致，结肠CD4+T细胞分泌的IL-17A和IFN-γ也减少了。这些结果表明，富含致病性Th17细胞的口腔微生物群反应性T细胞群体可以迁移到肠道。到达肠道后，口腔微生物群反应性Th17细胞可通过与其同源抗原（即异位定居的口腔病原菌）反应而扩增，从而促进结肠炎的发展。口腔病原菌诱导的肠粘膜IL-1β也可能参与了转移的口腔T细胞的活化和扩增。
图十二：经口刺激的T细胞的肠道迁移加剧了结肠炎
到目前为止，我们已经证明牙周炎期间出现的口腔病原体反应性Th17细胞具有致结肠炎能力。然而，肠道转移的口腔Th17细胞参与结肠炎发病机制的程度尚不清楚。为了解决这个问题，我们使用了共生模型。如图所示，在CD45.2+WTC57BL/6小鼠（口腔T细胞的供体）中诱导了牙周炎。口腔结扎插入14天后，通过共生作用将这些小鼠手术连接至同基因CD45.1+小鼠。1周后，仅通过口服DSS法在CD45.1+小鼠中诱发结肠炎。这些小鼠也口服产气克雷伯菌为肠道迁移的口腔T细胞提供同源抗原。当同时给予产气克雷伯菌/DSS时，与连接到健康小鼠的CD45.1+的小鼠相比（组3），连接到牙周炎CD45.2+小鼠的CD45.1+小鼠发展显著更严重的结肠炎（组4）。
在第4组小鼠中，我们观察到（源自相连的牙周炎小鼠）的CD45.2+CD3+CD4+T细胞大量迁移到CD45.1+小鼠的结肠粘膜中。这些来自牙周炎小鼠的肠道迁移的T细胞显示出RORγt+和RORγt+T-bet+Th17细胞表型，实际上产生了大量的IL-17A和IFN-γ。重要的是，当未供应产气克雷伯菌时（第5组），与牙周炎小鼠的连接并没有使DSS结肠炎恶化，也没有增加与牙周炎小鼠相关的Th17细胞的肠道迁移（第5组），这表明肠道中存在口腔病原菌是口腔Th17细胞的数量增加，随后这些细胞在肠道中诱导肠道炎症的先决条件。
总结
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